大肠杆菌的系统代谢工程已被研究并应用于生物燃料和建筑材料的合成。它结合了整个生物过程的系统生物学和合成生物学，有助于制定有效的策略来修改微生物菌株，以最大化目标化学品的产量和生产效率，同时最小化整个上下游工艺成本。常用的技术主要包括基因敲除、自身代谢途径的过度表达、以及引入新的代谢途径等。

本文综述了大肠杆菌系统代谢工程改造自身代谢途径的策略以及开发生产生物燃料和积木的微生物所使用的工具和策略，以期为研究人员提供合成目标化合物的整体方法。使用大肠杆菌的化合物。思路和方法。

1 大肠杆菌代谢途径的修饰 1.1 丙酮酸代谢途径的修饰

丙酮酸是重要的有机中间体，可用于合成L-色氨酸、L-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸等药物。还可用于合成阿托酸、丙酮酸乙酯等。农药中间体的合成[]。在大肠杆菌中，丙酮酸是糖酵解途径中重要的代谢中间体，可用于乳酸、丙氨酸、乙酸和乙酰辅酶A的合成，以及乙二醇、2,3-丁二醇和异丁醇的合成等.[-].目前修饰丙酮酸途径的主要方法有3种。首先，降低丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）的活性。 PDHC由三个亚基组成，其中包括由aceE基因编码的EI亚基。 ，即丙酮酸脱氢酶； aceF基因编码的E2亚基，即二氢乙酰胺转乙酰酶转乙酰酶）； IpdA基因编码的E3亚基，即二氢硫辛酰胺脱氢酶（DiHydrolipoamide dehydrogenase）。宋灿辉等利用Red重组系统构建了营养缺陷型菌株MG1655。敲除大肠杆菌PDHC中的aceE基因后，丙酮酸进入TCA循环的流动被阻断，并促进了丙酮酸的积累。其次，降低α-酮戊二酸脱氢酶复合物（AKGDH）的活性。 AKGDH由3个亚基组成，其中包括sucA编码的E1亚基，即α-酮戊二酸。脱羧酶（α-酮戊二酸脱羧酶，KCBX）； sucB基因编码的E2亚基，即硫辛酸转琥珀酰酶(Lipoyl transsuccillylase，LTS)和IpdA基因编码的E3亚基。 Causey等人通过敲除atpFH、adhE和sucA基因降低了ATP合成、细胞生长和CO2产生的速率，从而增强了葡萄糖向丙酮酸的积累。三是减少丙酮酸代谢分支，减少丙酮酸的消耗。大肠杆菌 YYC202 是一种成功设计用于丙酮酸积累的营养缺陷型菌株，具有编码丙酮酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、丙酮酸甲酸裂合酶和丙酮酸氧化酶的突变。该基因消除了可以消耗丙酮酸的下游代谢[-]。从目前的研究可以看出，促进大肠杆菌中丙酮酸积累的策略主要有两种。一是提高丙酮酸的合成率，减少反馈抑制调节；二是去除丙酮酸的代谢分支，减少丙酮酸的消耗。 。

1.2 乙酰辅酶A代谢途径的修饰

乙酰辅酶A是微生物代谢的重要中间体。它既是TCA循环的起始化合物，也是脂肪酸合成的前体。乙酰辅酶A可以通过丙酮酸转化为多种化学物质，包括1-丁醇、丁酸、S-3-羟基丁酸和聚-3-羟基丁酸[-]。

有两种方法可以实现乙酰辅酶A的积累。一是调节PDHC的活性。在有氧条件下，PDHC可以将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。然而，PDHC在缺氧或厌氧条件下活性较低。为了解决这个问题，Kim等[]对编码PDHC的基因中的lpdA基因进行了突变（将E354突变为K），使其在缺氧条件下仍能保持活性。博尔特等人。 【】突变肺炎克雷伯菌中的lpdA基因（突变D354为K）并取代了大肠杆菌中的lpdA基因。结果表明，转基因大肠杆菌可以在相对较高的含氧量下运行。低温环境下的生长提高了细菌积累乙酰辅酶A的能力。二是代谢途径中相关基因的过度表达。在丙酮酸合成乙酰辅酶A途径中，PDHC中相关基因（如aceE、aceF、lpdA）的过表达已被应用于1-丁醇或脂肪酸的合成[-]。 Lin等人通过过表达乙酰辅酶A合酶acs基因促进乙酸盐转化为乙酰辅酶A，且不影响大肠杆菌的生长。目前对乙酰辅酶A积累的代谢途径修饰主要是通过增加PDHC活性、促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A、过表达乙酰辅酶A合成相关酶来促进碳流向乙酰辅酶A途径。

1.3 甲羟戊酸代谢途径的修饰

近年来，甲羟戊酸作为萜烯和类胡萝卜素的前体化合物备受关注，在医药、清洁能源和芳香化学品等方面具有广阔的应用前景[-]。甲羟戊酸代谢途径首先以乙酰辅酶A为前体，转化为甲羟戊酸，然后通过三步反应转化为异戊烯基焦磷酸（IPP）。 IPP用于合成萜类化合物和类胡萝卜素。基本结构单元，但将甲羟戊酸转化为IPP的代谢途径在大肠杆菌中不存在。其自身IPP的合成需要甲基赤藓糖醇磷酸酯（DXP）作为前体，这成为大肠杆菌合成的主要限制因素，萜类化合物。目前，只能通过引入异源代谢途径来修饰大肠杆菌的甲羟戊酸途径。马丁等人。 []结合青蒿和酿酒酵母中的紫穗槐二烯合酶ads基因，在大肠杆菌中构建了完整的异源甲羟戊酸代谢途径，最终生成紫穗槐二烯，即青蒿素合成的前体。 Harada等人将链霉菌的甲羟戊酸途径克隆到大肠杆菌中，然后转入α-葎草烯合酶基因并检测了目标产物的产生。 Morrone等人在大肠杆菌中引入了异源甲羟戊酸代谢途径，结果表明异源代谢途径比内源代谢途径产生更多的二萜类化合物。由于甲羟戊酸是乙酰辅酶A的下游代谢，因此修饰大肠杆菌中的乙酰辅酶A代谢途径也可​​用作增加甲羟戊酸及其衍生物产量的策略。

1.4 莽草酸代谢途径的修饰

莽草酸是环己烷的羟基化不饱和酸衍生物，具有预防血栓、抗炎、镇痛等作用，是合成神经氨酸酶抑制剂的关键成分[]。大肠杆菌可以利用莽草酸产生不同类型的芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸[]。

修饰莽草酸途径的主要方法有3种。一是敲除莽草酸激酶基因。莽草酸激酶将莽草酸转化为 3-磷酸莽草酸。敲除该基因可以抑制莽草酸向下游代谢的转化。 Draths等[]消除了大肠杆菌中的莽草酸激酶基因，并过表达对莽草酸积累具有反馈抑制作用的AroF、AroE和AroB基因，从而避免了莽草酸激酶基因缺失对细菌生长的影响。二是促进磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和赤藓糖4-磷酸（E4P）的合成。 PEP和E4P是大肠杆菌中合成莽草酸的前体。野田等人。 [] 在大肠杆菌中过表达 PEP 合成。酶ppsA基因和转酮酶tktA基因提高了PEP和E4P的合成效率。 Gosset 和 Sengupta 等人[-] 通过突变 pykA 和 pykf 基因、过度表达 tktA 基因、抑制丙酮酸激酶活性和 PEP 介导的葡萄糖转运，增加了 PEP 在大肠杆菌中的可用性。该方法用于改进顺式-甲基丙烯酸和水杨酸的合成。三是减少副产物，促进反应向莽草酸方向发展。克莱默等人。 []敲除大肠杆菌中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因aroA，并过表达AroF、AroB和AroL基因。生成的3-磷酸莽草酸有助于将反应推向生成莽草酸的方向，同时副产物3-脱氢莽草酸的含量减少。

2 用于生物燃料合成的大肠杆菌

随着基因工程技术的发展和生物信息资源的日益丰富，微生物可以转化为合成多种生物燃料（如1-丙醇、1-丁醇和碳氢化合物）所需的工程菌。 1-丙醇是一种重要的化学品，在多种工业产品中用作汽油替代品[]。 Choi等[]利用氨基酸生物合成途径的反馈抑制作用，消除大肠杆菌中的竞争性代谢途径，增强2-酮丁酸的合成。然后他们引入了 adhE 基因并删除了一个应激反应基因。改造后的大肠芽孢杆菌可以分别以葡萄糖和甘油为碳源合成1-丙醇。 jian等[]将异源1,2-丙二醇代谢途径中的关键基因，包括丙酮醛合成酶mgsA基因、丙二醇脱水酶budC基因、丙酮醛还原酶ydjG基因和ppdABC操纵子导入大肠杆菌中。用于合成1-丙醇。 1-丁醇也是重要的汽油替代品。传统的合成方法主要是通过梭菌发酵生产[-]。大肠杆菌本身合成1-丁醇的能力较弱。沉等人。 []将丙酮丁醇梭菌的丁酰辅酶A基因和乙酰辅酶A酰基转移酶基因导入大肠杆菌中并敲除。大肠杆菌中与复杂酸合成相关的基因增强了大肠杆菌合成1-丁醇的能力。碳氢化合物也是一种有前途的生物燃料。 4至12个碳的短链烃可用作汽油替代品，13至17个碳的长链烃可用作柴油替代品[]。通过将蓝细菌烷烃生物合成途径中的酰基载体还原酶AAR基因和醛脱羧酶ADC基因导入大肠杆菌，可以合成十三至十七个碳的长链烃混合物。

3 大肠杆菌用于合成构件

微生物代谢可产生不同类型的聚合物合成构件，如微生物初级代谢产生的二羧酸、羟基酸、短链二醇和二胺等。已有研究通过基因改造获得合成效率更高的工程菌，但还需要进一步改进才能实现商业化生产。二元酸主要包括琥珀酸、富马酸、苹果酸、戊二醛、葡萄糖酸、己二酸和3-羧基糖醛酸。其中，关于琥珀酸合成的研究较多，早期研究人员已将后者转化为大肠杆菌，用于需氧、厌氧和需氧-厌氧三种发酵方法[-]。随后，研究人员将有氧条件下合成琥珀酸的代谢系统引入大肠杆菌中，提高了琥珀酸的合成效率。他们将三羧酸循环途径和副产物产生途径转化为乙醛酸循环和三羧酸循环的氧化分支，使大肠杆菌能够有效积累琥珀酸，同时保证正常生长。随后，谷氨酸棒杆菌中的丙酮酸羧化酶pyc基因在大肠杆菌中过表达，促进草酰乙酸合成并增强离子流向三羧酸循环的氧化分支，最终提高大肠杆菌在有氧条件下发酵产生的琥珀酸的产量达到 36.1 克/升[]。

短链二醇是生产聚酯和其他化学品的基础材料。它们可以通过微生物自身的代谢和改变的代谢途径产生，例如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、4-丁二醇和1,3-丁二醇。微生物生产1,4-丁二醇体现了代谢途径基因改造工程在工业菌株设计中的应用和发展。 Boldt等[]利用代谢途径识别软件（SimPheny bioPathway Predictor）设计了可以从一些常用的代谢中间体合成1,4-丁二醇的代谢途径，然后根据产物的长度、热力学和产率选择最佳途径。代谢途径。对大肠杆菌进行改造，然后通过基因组代谢成分的生物信息学分析和密码子优化技术，敲除部分基因，进一步优化合成途径。最终1,4-丁二醇收率可达18 g/L。本实验室利用羰基还原酶在大肠杆菌中过表达来合成R-1,3-丁二醇。 R-1,3-丁二醇的产率为8g/L。

羟基酸及其手性化合物不仅可用作生产药物、维生素、抗生素和风味化合物的前体，还可用作合成聚酯的生物单体。它们包括乳酸、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸[-]。微生物基因工程已成功应用于乳酸的合成。其中，以葡萄糖或甘油为碳源的大肠杆菌过量生产乳酸的研究最具潜力。研究人员对大肠杆菌氧化还原反应的全基因组分析表明，在厌氧条件下，D-乳酸过量产生是由与核苷酸和氨基酸代谢相关的单个脱氢酶基因决定的，例如guaB、pyrD和serA。此外，敲除与厌氧转录调控相关的guaB、pyrD、serA、fnr、arcA或arcB基因可以增强D-乳酸的过量生产[-]。

4 总结与展望

本文综述了大肠杆菌中丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸四种代谢途径的修饰策略，以及大肠杆菌用于合成生物燃料和构件的系统代谢工程策略。现有研究表明，将系统生物学和合成生物学整合到代谢工程中，在开发能够有效生产目标化合物的工程菌株方面具有广阔的前景。我们实验室采用该策略转化大肠杆菌，实现了R-3-奎尼多的中试生产。该策略也已成功用于氨基酸、乳酸、琥珀酸、1,4-丁二醇和1,3-丙二醇。的生产。使用修饰的大肠杆菌生产目标化合物时，仍存在一些需要改进的领域，包括最大限度地提高产品纯度、收率和反应效率；在工业应用中，需要综合考虑上下游工艺的可操作性和匹配性。系统代谢工程将在缩短菌株反应时间、降低反应成本以及生物工艺开发、最终实现目标化合物的工业规模生产方面发挥越来越重要的作用。